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[Ninette_]

    La spettrofotometria molecolare UV/visibile si basa sull'assorbimento selettivo, da parte di molecole (eventualmente ionizzate), delle radiazioni con lunghezza d'onda compresa tra 10nm e 780nm.
-   UV lontano (λ<200nm): al di sotto di 200nm occorrono particolari accorgimenti, perché l'assorbimento da parte dell'ossigeno atmosferico copre i segnali di altre sostanze, perciò è necessario operare sottovuoto, o almeno in atmosfera di gas inerte.
-   UV vicino (200nm<λ<380nm) Sono gli spettrometri più comuni, il campione viene inserito in
contenitori (cuvette) di quarzo poiché le radiazioni coinvolte sono incapaci di attraversare il vetro comune.
-   Visibile (380nm<λ<780nm) Il campione può essere contenuto anche in cuvette di vetro trasparente, come rivelatore è sufficiente l'occhio umano.

   La legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche è detta legge di Lambert-Beer, e si applica a radiazioni monocromatiche:

A = εbC
dove A è l'assorbanza ad una data lunghezza d'onda, ε il coefficiente di assorbimento molare, b il cammino ottico (in cm) e C la concentrazione della specie che assorbe.

Strumentazione

   La sorgente produce luce policromatica che viene dispersa dal monocromatore; le singole radiazioni
monocromatiche, opportunamente selezionate, colpiscono la cella contenente l'analita in grado di assorbirle,
vengono attenuate e quindi colpiscono il rivelatore; questo produce una corrente elettrica proporzionale  all'intensità di luce incidente che viene misurata da un opportuno strumento di misura dotato di indicatore.
   Le sorgenti possono essere di vario tipo, a seconda della zona dello spettro interessata:
-   lampade a filamento di tungsteno: sono utilizzate nel campo VIS sia nei colorimetri che negli spettrofotometri; coprono l'intero campo spettrale da 300 a 930 nm circa. Lavorano a una temperatura di circa 3000 K e richiedono l'uso di stabilizzatori di tensione per emettere energia in modo costante. Contengono un filamento di W che viene riscaldato ad elevata temperatura mediante il passaggio di corrente elettrica (effetto Joule); il filamento si
riscalda fino all'incandescenza ed emette nel VIS.
-   lampada a deuterio: si tratta di una lampada ad arco in cui il cui bulbo di quarzo è riempito di deuterio (D2) a bassa pressione. I due elettrodi contenuti all'interno della lampada vengono sottoposti ad un'elevata differenza di potenziale, fino a che avviene la scarica. L'arco così prodotto ionizza il D2 e lo eccita, provocando un'intensa emissione quasi
continua nella regione UV dello spettro (inferiore a 400 nm).
   Il monocromatore scompone la radiazione policromatica in bande monocromatiche, che aumentano la precisione dell'analisi del campione. Ogni monocromatore è abbinato ad una fenditura, di ampiezza regolabile (dell'ordine di qualche nm), che permette di selezionare l'intervallo di radiazioni desiderato. Si dividono in due categorie:
-   filtri, che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione incidente trasmettendo le altre. Possono essere di assorbimento, come quelli usati in fotografia,sono fatti di vetro (e quindi non adatti all'analisi UV) e la banda può essere ristretta fino a 35/60nm; o ad interferenza (di scattering) con bande passanti di 10/20nm e trasmissione di circa il 50% dell'energia.
-   prismi e reticoli, che separano angolarmente le diverse radiazioni monocromatiche.
Quando una radiazione colpisce un prisma ottico, essa viene dispersa nelle sue componenti monocromatiche, con angoli diversi. Il potere disperdente, in particolare, aumenta con il diminuire della lunghezza d'onda. Fenditure più ampie trasmettono maggiore energia, ma in questo modo il potere risolvente diminuisce e si allarga la banda passante.
I reticoli possono essere di due tipi, a seconda che la radiazione venga riflessa o li attraversi:
   reticoli di trasmissione: su una superficie di alluminio vengono incise una serie sottilissima di fenditure, con procedimenti di tipo fotografico.
   reticoli di riflessione: sono costituiti da una serie di solchi paralleli tracciati su una superficie riflettente, piana o concava. Colpiti da radiazioni, danno origine ad uno spettro costituito da frange di diffrazione simili a quelle ottenuti con reticoli di trasmissione.
Ogni monocromatore è caratterizzato da alcuni parametri tipici, tra cui:
-   lunghezza d'onda nominale (λn): è la λ corrispondente al massimo di intensità di luce trasmessa, cioè in
corrispondenza di Imax (coincide approssimativamente con il colore del filtro nel caso di filtri colorati per il VIS)
-   ampiezza della banda passante (SBW = Spectral Band Width), definita come l'intervallo di lunghezze d'onda che emerge dalla fenditura con un'energia superiore al 50% della radiazione nominale; è quindi la larghezza della banda di trasmissione del monocromatore misurata a Imax/2.
   Le celle (o cuvette) possono essere:
-   A sezione circolare di vetro ottico, con diametro variabile tra 1 a 5cm, solitamente usate per colorimetri monoraggio
-   A forma di parallelepipedo di sezione quadrata,con cammino ottico di 1cm. Possono essere in vetro, polistirene o quarzo.
-   Microcelle con cammino ottico di 1cm per piccoli volumi
   I rivelatori trasformano l'energia radiante in un segnale elettrico, e sono genericamente detti celle fotoelettriche:
-   Fotocella a vuoto (fototubo): sfrutta l'effetto fotoelettrico, consistente nell'emissione di elettroni da parte di  superfici metalliche colpite da fotoni, che quindi convertono l'energia luminosa in energia elettrica. Si utilizzano metalli con bassi potenziali di ionizzazione (energia necessaria per strappare un elettrone). Un fototubo è costituito da un tubo a vuoto di vetro (con una finestrella di quarzo per consentire il passaggio sia delle radiazioni VIS sia delle radiazioni UV), contenente un catodo ricoperto di una sostanza fotosensibile solito una lega Cs-Sb) e per tale motivo detto anche fotocatodo e da un anodo a griglia, che permette il passaggio delle radiazioni luminose. Tra i due elettrodi, una sorgente di corrente continua mantiene un'opportuna d.d.p. (circa 90 V).
-   Fotomoltiplicatore: sfrutta sempre l'effetto fotoelettrico ma è in grado di amplificare il segnale prodotto, riuscendo quindi ad essere sensibili ad intensità luminose molto più basse rispetto ai comuni fototubi.In un fototubo, la luce che colpisce il catodo fotosensibile ionizza il materiale del catodo e produce una corrente dell'ordine di 50 μA mediante emissione primaria; si tratta di un valore molto basso di difficile manipolazione. Nei fotomoltiplicatori, vi sono diverse coppie di elettrodi, dette dinodi, tutti ricoperti di materiale fotosensibile, sottoposti a tensioni progressivamente crescenti: in questo modo ogni elettrone espulso da un dinodo viene accelerato dalla crescente tensione elettrica e produce una emissione secondaria di più elettroni sul dinodo successivo.
-   Celle fotovoltaiche e fotoconduttive: sfruttano le proprietà dei semiconduttori, in  cui gli elettroni più esterni possono essere eccitati con facilità nella rispettiva banda di conduzione. Queste transizione elettroniche generano energia elettrica, la cui ddp è direttamente proporzionale al numero di fotoni che raggiungono il rivelatore.